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肿瘤研究必备——Transwell侵袭实验步骤及注意事项

实验指南

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    肿瘤研究必备——Transwell侵袭实验步骤及注意事项
    肿瘤研究必备——Transwell侵袭实验步骤及注意事项
    肿瘤细胞通过膜表面特定受体与基质或基底膜粘连,而后可以释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原,降解基质,最后细胞运动而充填到被水解的基质空隙处。这个过程不断重复,肿瘤细胞则不断地向深层侵袭。

      一提到对肿瘤的研究,必离不开对细胞功能的研究,其中肿瘤细胞的迁移、侵袭功能研究是必不可少的,肿瘤细胞的迁移侵袭能力的研究,也为后续信号通路、功能机制研究打下基础。由此可见,做好Transwell迁移实验是多么的必要。

      Transwell 侵袭实验主要用于检测肿瘤细胞体外的侵袭能力,今天小编就带大家了了解一下详细的实验步骤及注意事项。

      基本原理

      Transwell侵袭实验是用一层聚碳酸酯膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开,细胞接种到低营养的培养液里,通常膜孔都被Matrigel覆盖,模仿细胞外基质,肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有Matrigel的滤膜,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力,其原理图下图所示:


      应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多方面的研究。不同细胞其体积不同,具体选择时要考虑到细胞大小。

      实验主要材料和试剂

      8.0μm transwell小室、24孔板、棉签;含10% FBS的完全培养,无血清培养基、胰酶、PBS、Matrigel、4%多聚甲醛、结晶紫染色液

      操作步骤

      1、实验前一天,将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜,Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态。

      2包被基底膜:Matrigel基质胶以1:8稀释后包被transwell小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作,否则Matrigel在10℃以上即会凝固),3小时风干。

      3水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50μL 10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。

      4常规胰酶消化细胞,PBS洗1-2遍去除血清的影响,用无血清培养基重悬细胞,调整细胞密度为5*105个/mL。

      5取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室, 24孔培养板下室内加入600μL 含10% FBS培养基。注意下层培养液与小室之间不要产生气泡。

      6培养板置于37℃的CO2培养箱中,依据肿瘤细胞侵袭能力而定培养12-48h。

      7取出小室,PBS淋洗2遍,用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞,在24孔板内4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min,结晶紫溶液染色15 min。

      8倒置显微镜下拍照,每个样本随机计数10个视野,取平均值,统计分析。

      注意事项

      1、细胞接种剂量不同的细胞,其侵袭能力是不同的,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,最后会难以统计结果;而细胞量过少,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,进入下室。因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。

      几种常见细胞的每孔接种数量如下表:(个人经验,不同实验室可能略有差异)


      2、避免产生气泡下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,将小室放入培养板时要注意,如有气泡产生,须将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

      3、检测时间点培养时间主要依癌细胞侵袭能力而定,时间点的选择除了要考虑到细胞、细胞侵袭力及处理因素等。

      4、注意事项用棉签擦掉上室细胞时注意不要蹭到已穿膜的那一层细胞。

      5、对于比较难穿膜的细胞,可以在实验开展前撤掉血清节饥饿处理12h-24h。

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